Kuzey Güney ve Batı Lekesi Arasındaki Fark

Temel Fark - Kuzey - Güney - Batı Blotting
 

Belirli DNA, RNA ve protein dizilerinin tespiti Moleküler biyolojide yapılan çeşitli çalışma türleri için gereklidir. Jel elektroforezi DNA, RNA ve proteinleri boyutlarına göre ayıran bir tekniktir. Jel profillerden, belirli DNA sekansı, RNA sekansı veya protein, etiketli problarla lekeleme ve hibridizasyon adı verilen özel tekniklerle tespit edilir. Güney, kuzey ve batı olmak üzere üç farklı tipte kurutma yöntemi vardır. Kuzey güney ve batı lekeleme arasındaki temel fark, bir örnekten tespit ettiği molekül tipine dayanır.. Southern blotting, bir DNA numunesinden spesifik bir DNA sekansını tespit eden bir yöntemdir. Northern blotting, bir RNA örneğinden spesifik bir RNA sekansını tespit eden bir tekniktir. Western blotting, bir protein örneğinden spesifik bir proteini tespit eden bir yöntemdir.

İÇİNDEKİLER
1. Genel Bakış ve Temel Fark
2. Southern Blotting nedir
3. Kuzey Lekesi Nedir?
4. Western Blotting nedir
5. Yan Yana Karşılaştırma - Northern vs Southern Blotting
6. Özet

Southern Blotting nedir?

Southern blotting tekniği 1975 yılında bir DNA numunesinden spesifik bir DNA sekansının tanımlanması için E. M. Southern tarafından geliştirilmiştir. Bu, moleküler biyolojide tanıtılan ilk kurutma tekniğidir. DNA'dan spesifik genlerin, DNA'dan spesifik fragmanların, vb. Saptanmasını mümkün kılmıştır. Güney kurutma tekniğinde birkaç adım vardır. Bunlar aşağıdaki gibidir.

1. DNA numuneden izole edilir ve restriksiyon endonükleazları ile sindirilir.
2. Sindirilen numune Agarose jel elektroforezi ile ayrılır.
3. Jeldeki DNA fragmanları bir alkalin çözeltisi kullanılarak tek iplikçiklere denatüre edilir.
4. Tek iplikçikli DNA, kılcal transfer yoluyla bir nitroselüloz filtre zarına aktarılır.
5. Aktarılan DNA zar üzerine kalıcı olarak sabitlenir.
6. Membrandaki sabit DNA etiketli problarla hibritlenir.
7. Bağlanmamış DNA zardan yıkanarak yıkanır.
8. X-ışını filmi membrana maruz bırakılır ve bir otoradyograf hazırlanır.

Southern blotting, moleküler biyolojinin farklı yönleri için uygulanır. RFLP haritalaması, adli çalışmalar, gen ekspresyonunda DNA metilasyonu, genetik bozukluklarda mutasyona uğramış genlerin tespiti, DNA parmak izi, vb..

Şekil 01: Güney Lekesi Tekniği

Northern Blotting nedir?

Northern blotting, gen ekspresyonunu incelemek için bir örnekten spesifik bir RNA sekansını veya mRNA sekansını saptamak için tasarlanmış bir yöntemdir. Bu teknik, 1979'da Alwine, Kemp ve Stark tarafından geliştirilmiştir. Birkaç adımdan dolayı, ekşi ve batı lekeleme tekniklerinden farklıdır. Bununla birlikte, bu teknik jel elektroforezi, lekeleme ve spesifik etiketli problarla hibridizasyon ve tespit yoluyla da gerçekleştirilir. Northern blotting tekniği aşağıdaki gibi yapılır.

1. RNA numuneden ekstrakte edilir ve jel elektroforezi ile ayrılır.
2. RNA jelden bir lekeleme zarına aktarılır ve sabitlenir.
3. Membran, cDNA veya RNA'dan hazırlanan etiketli bir prob ile muamele edilir (prob, numunedeki spesifik bir sekansı tamamlar)..
4. Prob, belirli bir sekansla bağlanmak için zarla inkübe edilir.
5. Bağlı olmayan problar yıkanır.
6. Hibridize fragmanlar bir otoradyograf ile tespit edilir.

Northern blotting, hibridize mRNA'nın saptanması ve miktarının belirlenmesi, RNA bozulmasının incelenmesi, RNA yarılanma ömrünün değerlendirilmesi, RNA ekinin saptanması, gen ekspresyonunun incelenmesi, vb. İçin önemli bir araçtır..

Resim 02: Kuzey Lekesi

Western Blotting nedir?

Western blotting, etiketli antikor kullanılarak bir protein karışımından spesifik bir proteinin saptanması için bir yöntemdir. Bu nedenle, batı lekesi aynı zamanda immunoblotting. Bu teknik Towbin tarafından tanıtıldı et al Protein analizi için laboratuvarlarda rutin olarak uygulanmaktadır. Adımlar aşağıdaki gibidir.

1. Proteinler numuneden ekstrakte edilir
2. Proteinler poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak boyutlarına göre ayrılır.
3. Ayrılmış moleküller elektroporasyon yoluyla bir PVDF membranına veya nitroselüloz membrana aktarılır
4. Membran, antikorlarla spesifik olmayan bağlanma nedeniyle bloke edilir
5. Aktarılan proteinler birincil antikorla (enzim etiketli antikorlar) bağlanır.
6. Membran, spesifik olarak bağlı olmayan primer antikorları uzaklaştırmak için yıkanır
7. Bağlı antikorlar, bir substrat ilave edilerek ve oluşan renkli çökeltinin saptanmasıyla tespit edilir

Western blotting, bir insan serum örneğindeki anti-HIV antikorlarının saptanmasında faydalıdır. Western blot, Hepatit B enfeksiyonu için doğrulayıcı test ve deli inek hastalığı için kesin test olarak da kullanılabilir.

Resim 03: Western Blotlama

Northern Southern ve Western Blotting arasındaki fark nedir?

Kuzey vs Güney vs Batı Blotting
Tespit Edilen Molekül Tipi
Northern Blotting	Northern blotting, bir RNA örneğinden spesifik bir RNA sekansı saptar.
Güney lekelenmesi	Southern blotting, bir DNA örneğinden spesifik bir DNA sekansı tespit eder.
Western Blotlama	Western blotting, bir protein örneğinden spesifik bir proteini tespit eder.
Jel Tipi
Northern Blotting	Agarose / formaldehit jel kullanır.
Güney lekelenmesi	Bu bir Agarose jeli kullanır.
Western Blotlama	Poliakrilamid jel kullanır.
Kurutma Yöntemi
Northern Blotting	Bu bir kılcal transfer.
Güney lekelenmesi	Bu bir kılcal transfer.
Western Blotlama	Bu bir elektrik transferi.
Kullanılan Problar
Northern Blotting	Radyoaktif veya radyoaktif olmayan olarak etiketlenmiş cDNA veya RNA probları.
Güney lekelenmesi	DNA probları radyoaktif veya radyoaktif olmayan olarak etiketlenir.
Western Blotlama	Birincil antikorlar prob olarak kullanılır.
Tespit Sistemi
Northern Blotting	Bu bir otoradyografi veya ışık veya renk değişiminin tespiti kullanılarak yapılır.
Güney lekelenmesi	Bu bir otoradyografi, ışık veya renk değişiminin tespiti kullanılarak yapılır.
Western Blotlama	Bu, ışık veya renk değişimi tespiti kullanılarak yapılır.

Özet - Kuzey vs Güney vs Batı Blotting

Lekeleme, numunelerden spesifik DNA, RNA veya proteinin tanımlanması için geliştirilmiş özel bir tekniktir. Belirli bir molekül türünü tespit etmek için üç ayrı kurutma prosedürü vardır: kuzey, güney ve batı. Northern blotting tekniği, bir RNA karışımından spesifik bir RNA sekansını tespit etmek için tasarlanmıştır. Southern blotting tekniği, bir DNA numunesinden spesifik bir DNA sekansının saptanmasına olanak tanır ve western blot tekniği, bir protein karışımından spesifik bir proteini tanımlamak için geliştirilmiştir.

Referanslar
1. Gibbons, Janay. “Western Blot: Protein Transferine Genel Bakış.” Kuzey Amerika Tıp Bilimleri Dergisi. Medknow Yayınları ve Medya Pvt Ltd, Mart 2014. Web. 27 Mart 2017
2. Brown, T. “Güney lekesi.” İmmünolojide güncel protokoller. ABD Ulusal Tıp Kütüphanesi, Mayıs 2001. Web. 27 Mart 2017
3. O, L. L. “Kuzey lekesi.” Enzimolojide yöntemler. ABD Ulusal Tıp Kütüphanesi, 2013. Web. 27 Mart 2017

Görünüm inceliği:
1. “Northern Blot Şeması” RNA405 tarafından - Commons Wikimedia üzerinden kendi çalışması (Kamusal Alan)
2. “Western blot 114A” Amanthabagdon tarafından - Commons Wikimedia üzerinden kendi çalışması (Public Domain)