Sanger Sıralaması ve Pyrosequencing Arasındaki Fark

Temel Fark - Sanger Sıralaması ve Pyrosequencing
 

DNA dizilimi, DNA analizi için çok önemlidir, çünkü belirli bir DNA bölgesindeki doğru nükleotit düzenlemesinin bilgisi, bu konuda birçok önemli bilgiyi ortaya çıkarır. Farklı DNA sekanslama yöntemleri vardır. Sanger sekanslama ve Pyrosequencing, Moleküler Biyolojide yaygın olarak kullanılan iki farklı DNA sekanslama yöntemidir. Sanger dizilimi ve Pyrosequencing arasındaki temel fark şudur: Sanger sekanslama, nükleotit sekansını okumak için DNA sentezini sona erdirmek için dideoksinükleotitleri kullanır, pirozquencing ise nükleotitleri dahil ederek ve sekansın kesin sırasını okumak için tamamlayıcı sekansı sentezleyerek pirofosfat salınımını tespit eder..

İÇİNDEKİLER
1. Genel Bakış ve Temel Fark
2. Sanger Sıralaması Nedir
3. Pyrosequencing nedir
4. Yan Yana Karşılaştırma - Pyreyquencing vs Sanger Sekanslama
5. Özet

Sanger Sıralaması Nedir?

Sanger sekanslama, Frederick Sanger ve kolejleri tarafından 1977'de geliştirilen birinci nesil DNA sekanslama yöntemidir. Zincir Sonlandırma Sıralaması veya Dideoxy sıralama çünkü dideoksinükleotidler (ddNTP'ler) tarafından zincir sonlandırılmasına dayandırılır. Bu yöntem, Yeni Nesil Dizileme (NGS) geliştirilinceye kadar 30 yıldan fazla bir süredir yaygın olarak kullanılmıştır. Sanger sekanslama tekniği, doğru nükleotit sırasının keşfedilmesini veya belirli bir DNA fragmanının bağlanmasını sağladı. DdNTP'lerin seçici olarak dahil edilmesine ve DNA sentezinin laboratuvar ortamında DNA kopyalama. Bitişik nükleotitler arasında fosfodiester bağ oluşumunu sürdürmek için 3 'OH gruplarının bulunmaması, ddNTP'lerin eşsiz bir özelliğidir. Dolayısıyla, ddNTP bağlandığında, zincir uzaması durur ve bu noktadan sonlanır. Sanger sıralamasında kullanılan dört ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP ve ddTTP vardır. Bu nükleotitler, büyüyen DNA zincirine dahil edildiklerinde DNA replikasyon işlemini durdurur ve değişen uzunluklarda kısa DNA ile sonuçlanır. Kılcal jel elektroforezi, bu kısa DNA ipliklerini Şekil 01'de gösterildiği gibi bir jel üzerindeki boyutlarına göre düzenlemek için kullanılır..

Şekil 1: Sentezlenmiş kısa DNA'nın kılcal jel elektroforezi

İçin laboratuvar ortamında DNA'nın replikasyonu, birkaç gereklilik sağlanmalıdır. Bunlar DNA polimeraz enzimi, şablon DNA, oligonükleotid primerleri ve deoksinükleotitlerdir (dNTP'ler). Sanger sekanslamada DNA replikasyonu, dört tip ddNTP ile birlikte dört ayrı test tüpünde gerçekleştirilir. Deoksinükleotitlerin yerini tamamen ilgili ddNTP'ler almaz. Belirli bir dNTP'nin bir karışımı (örneğin; dATP + ddATP) tüpe dahil edilir ve çoğaltılır. Dört ayrı tüp ürünü, dört ayrı oyukta bir jel üzerinde çalıştırılır. Daha sonra jeli okuyarak, sekans Şekil 02'de gösterildiği gibi yapılandırılabilir.

Resim 02: Sanger sıralaması

Sanger sekanslama, moleküler biyolojinin birçok alanında yardımcı olan önemli bir tekniktir. İnsan genom projesi, Sanger dizileme tabanlı yöntemler yardımıyla başarıyla tamamlandı. Sanger sekanslaması aynı zamanda hedef DNA sekanslaması, kanser ve genetik hastalık araştırmaları, gen ekspresyon analizi, insan tanımlama, patojen tespiti, mikrobiyal sekanslama vb..

Sanger dizilemesinin birkaç dezavantajı vardır:

• Dizilenen DNA'nın uzunluğu 1000 baz çiftinden uzun olamaz
• Bir seferde yalnızca bir iplik dizilebilir.
• İşlem zaman alıcı ve pahalıdır.

Bu nedenle, bu sorunların üstesinden gelmek için zamanla yeni gelişmiş sekanslama teknikleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, Sanger dizileme, yaklaşık 850 baz çifti uzunluk parçasına kadar son derece hassas sonuçları nedeniyle hala kullanılmaktadır..

Pyrosequencing nedir?

Pyrosequencing “sentez yoluyla sıralama” temelli yeni bir DNA sıralama tekniğidir. Bu teknik, nükleotid katkısı üzerine pirofosfat salımının saptanmasına dayanır. İşlem dört farklı enzim tarafından kullanılır: DNA polimeri, ATP sülfürilaz, lusiferaz ve apyraz ve iki substrat adenosin 5 'fosfosülfat (APS) ve lusiferin.

İşlem, primerin tek iplikçikli DNA şablonu ile bağlanmasıyla başlar ve DNA polimeraz, ona tamamlayıcı nükleotitlerin dahil edilmesine başlar. Nükleotidler bir araya geldiğinde (nükleik asit polimerizasyonu), pirofosfat (birbirine bağlı iki fosfat grubu) gruplarını ve enerjisini serbest bırakır. Her nükleotid ilavesi eşmolar miktarda pirofosfat salar. Pirofosfat, substrat APS varlığında ATP sülfürilaz ile ATP'ye dönüşür. Üretilen ATP, lusiferazın aracılık ettiği lusiferinin oksilusiferine dönüştürülmesini sağlar ve ATP miktarıyla orantılı miktarlarda görünür ışık üretir. Işık bir foton algılama cihazı veya fotoçoğaltıcı tarafından tespit edilir ve bir pirogram oluşturur. Apyrase, reaksiyon karışımındaki ATP ve katılmamış dNTP'leri bozar. dNTP ekleme işlemi her seferinde bir kez yapılır. Nükleotid ilavesi, ışığın dahil edilmesi ve saptanmasına göre bilindiği için, şablonun sekansı belirlenebilir. Pyrogram, Şekil 03'de gösterildiği gibi örnek DNA'nın nükleotit sekansını oluşturmak için kullanılır.

Pyrosequencing tek nükleotid polimorfizm analizinde ve kısa DNA dizilerinin dizilmesinde çok önemlidir. Yüksek doğruluk, esneklik, otomasyon kolaylığı ve paralel işleme, pirosequencing'in Sanger sıralama tekniklerine göre avantajlarıdır.

Resim 03: Pyrosequencing

Sanger Sekanslama ve Pyrosequencing arasındaki fark nedir?

Sanger Sıralaması vs Pyrosequencing
Sanger sekanslama, ddNTP'lerin DNA polimeraz tarafından seçici olarak dahil edilmesine ve zincir sonlandırmasına dayanan bir DNA sekanslama yöntemidir..	Pyrosequencing, nükleotidin katılması üzerine pirofosfat salımının saptanmasına dayanan bir DNA sıralama yöntemidir..
DdNTP kullanımı
ddNTP'ler DNA replikasyonunu sonlandırmak için kullanılır	ddNTP'ler kullanılmaz.
İlgili enzimler
DNA polimeraz kullanılır.	Dört enzim kullanılır: DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, Lusiferaz ve Apiraz.
Kullanılan Yüzeyler
APS ve Luciferin kullanılmaz.	Adenosin 5 'fosfosülfat (APS) ve lusiferin kullanılır.
Maksimum sıcaklık
Bu yavaş bir süreç.	Bu hızlı bir süreç.

Özet - Sanger Sekanslama vs Pyrosequencing

Sanger sekanslama ve Pyrosequencing moleküler biyolojide kullanılan iki DNA sekanslama yöntemidir. Sanger sekanslama, zincir uzamasını sonlandırarak nükleotitlerin sırasını yapılandırırken, pirozquencing nükleotitlerin dahil edilmesi ve pirofosfatların salınmasını tespit ederek nükleotitlerin kesin sırasını sırayla oluşturur. Bu nedenle, Sanger sekanslama ve Pyrosequencing arasındaki temel fark, Sanger sekanslamanın zincir sonlandırma ile sekanslama üzerinde çalışması, pyrosequencing ise sentez ile sekanslama üzerinde çalışmasıdır..

Referans:
1. Fakruddin, Md ve Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-Geleneksel Sanger Sekanslama Alternatifi." Amerikan Biyokimya ve Biyoteknoloji Dergisi. Bilim Yayınları, 02 Mart 2012. Web. 28 Şubat 2017.
2. “Sanger sıralaması.” Sanger sıralama - ScienceDirect Konular. N.p., n.d. Ağ. 28 Şubat 2017

Görünüm inceliği:
1. “Didesoxy-Methode” Christoph Goemans (modifiziert) tarafından - Commons Wikimedia üzerinden Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) tarafından hazırlanan Dr. Norman Mauder
2. “Sanger-DNA-seq” Enzo, Commons Wikimedia üzerinden Polonya dili Wikipedia'sında (CC BY-SA 3.0)
3. Flickr yoluyla mikrobiyolojibytes (CC BY-SA 2.0) tarafından “Pyrosequencing”